MICOSOIL inicia el genotipado de esporas de micorrizas de Euskadi

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Recogida de muestras de pasto y bosque en el Parque Natural de Gorbeia

Concluidas las tareas de recogida de muestras en el campo, durante la última quincena de julio de 2015 se han iniciado los trabajos genómicos del Proyecto MICOSOIL. En la fase actual del proyecto, el objetivo de estos trabajos se centra en la caracterización molecular de las especies/ variedades recolectadas.

 Se pretende obtener una caracterización genotípica que permita una revisión, y corrección en caso necesario, de la identificación de especies realizada preliminarmente a partir de morfotipos de esporas. De forma que posibilite una correcta identificación y manejo de especies y variedades, de los glomeromicetos autóctonos de Euskadi, en las fases posteriores del Proyecto.

 Los trabajos se iniciaron a partir de cuatro morfotipos predominantes, identificados de forma preliminar, referenciados como morfotipos: 22, 17, 14 y 14B respectivamente.

Concluidos los preparativos de los trabajos moleculares se han obtenido las siguientes apreciaciones:

 

Aislamiento esporas

Complementariamente a los trabajos de aislamiento de esporas realizados por la Unidad de Medio Ambiente de NEIKER, y como parte de las actividades preparatorias para el aislamiento de esporas se ha probado  el protocolo de tamizado en húmedo (Gerdemann & Nicolson, 1963), sin posterior centrifugado en gradiente de sacarosa, con resultados aceptables. De acuerdo con algunos autores (Shamini1 &. Amutha, 2014) que han encontrado una alta eficiencia en los resultados proporcionados por el mismo, superior incluso a la técnica de centrifugación en gradiente.

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Esporas segregadas correspondientes al morfotipo Ref. 22

 

Se probó igualmente una modificación del protocolo de Gerdemann & Nicolson aplicando un procesamiento con ultrasonidos previo al tamizado de la muestra que mejora notablemente sus resultados, de acuerdo a nuestras observaciones, facilitando el tamizado al proporcionar un alto grado de disgregación del suelo. Se ha comprobado igualmente que el baño de ultrasonidos previo al retamizado mejora igualmente los resultados, especialmente en suelos con alto  contenido de materia orgánica y/o partículas de reducido tamaño (limos, etc…)

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Microfotografía de agregados de suelo tras un tamizado inicial (0’5 mm)

 Selección y limpieza.

Descartada la aplicación de protocolos que empleasen el uso de aditivos químicos en la limpieza de las esporas se procedió a realizar la misma mediante baño de ultrasonidos de acuerdo al método indicado en la web de la INVAM (International Collection of Vesicular/Arbuscular Mycorrhizal Fungi -INVAM at West Virginia University), con resultados satisfactorios.

 

Extracción de ADN

Inicialmente se han probado los protocolos de extracción monoespora del INVAM, INRA y USAID (Dales et al. 1993)

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Aislamiento de una sola espora para extracción de su ADN.

 

 

El resultado de la extracción con una sola espora, aún resultando exitoso en algunas ocasiones, se considera muy difícilmente reproducible. En el laboratorio de BIOGENETICS hemos obtenido ADN a partir de una única espora en varias ocasiones, con cuantificaciones fluorométricas  de 0,92 y 1,15 ng (Qubit HS Assay) respectivamente. Ligeramente inferior a la concentración (1’5 – 2’0 ng) hallada por otros autores Adolphe & Gianinazzi (1993).

Fue imposible obtener lectura espectrofotométrica (Genequant II) para ninguna de las muestras.

Partiendo de una concentración conocida excesivamente baja, como era previsible, no se ha conseguido realizar exitosamente la amplificación PCR (ITS1-4) de estas muestras en ningún caso, aún en diferentes condiciones de termociclado y master mixtures.

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Termociclador portátil mini8, probado por BIOGENETICS en el Proyecto MICOSOIL para la amplificación de las muestras de esporas AMF (arbuscular mycorrhizal fungi)

 

Ambas muestras fueron extraídas empleando el protocolo del INRA (van Tuinen et al 1998b; Jacquot et al. 2000; Turnau et al. 2001), no consiguiéndose una extracción exitosa con el protocolo del INVAM y no siendo probado aún el método Burggraaf & Beringer (1989)

Se requeriría de un análisis posterior mas detallado para identificar las causas del fallo en la aplicación del protocolo INVAM, en cualquier caso se estima que el mantenimiento de la muestra en una dilución indeterminada de PCR buffer y ddH20  podría afectar probablemente a la efectividad, y con casi seguridad a la reproducibilidad, de la PCR (debido a la concentración de diversos aditivos comunes en los buffer PCR -Tris, KCl, etc…- y especialmente de MgCl2).

Las causas actualmente consideradas como origen del fallo de la amplificación se centran en: baja concentración inicial de ADN y la posible contaminación de la muestra por restos de inhibidores.

Las próximas acciones en la agenda de esta actividad serán:

  • Prueba de nuevos protocolos de extracción empleando un mayor número de esporas simultáneamente. Este tipo de extracción (a partir de múltiples esporas), se realizará tras una minuciosa identificación morfotípica de las mismas) ya que en caso contrario (mezcla de diferentes morfotipos, o incluso variedades o especies isomórficas) podría llevar a conclusiones erróneas sobre la heterogeneidad genética intra-núclear (esporas) de una determinada especie (heterocarionte). Y/o un aumento irreal de la variabilidad observada del rADN entre esporas -diferentes muestras de la misma especie/ morfotipo- (Redecker et al. 2003, Lanfranco et al. 1999), cuestionada recientemente por otros autores (Lin K. et al. 2014).
  • Puesta a punto de un protocolo de extracción mono-espora con especial atención a reducir la inespecificidad de la PCR, afectando por tanto a su reproducibilidad, y que podría dar lugar a una percepción irreal sobre la variabilidad del rADN entre esporas (Redecker et al. 2003). Que podría ser causada por las altas y variables concentraciones de MgCl2 empleadas en el protocolo de extracción, así como la variabilidad de otras condiciones de la PCR.
  • Continuar con los experimentos de optimización de la condiciones PCR.
  • Puesta a punto de un protocolo para la extracción de ADN de hongos AMF (arbuscular mycorrhizal fungi) a partir de raíces colonizadas. De forma que resulte posible el análisis de la identidad entre la diversidad estimada en base a esporas y las especies efectivamente endosimbiontes. Así como la confirmación de posible transferencia génica inter-específica por anastomosis, y la influencia de estos factores en la viabilidad local de inóculos comerciales basados en hongos AMF (Croll & SAnders, 2009) para su uso en agricultura ecológica, objetivo final del Proyecto MICOSOIL.